Гібридизація in situ

The in situ гібридизація є методом виявлення хромосомних аберацій. Окремі хромосоми позначені флуоресцентними барвниками та пов'язані з ДНК-зондом. Ця методика використовується для пренатальної діагностики генних мутацій.

Що таке гібридизація in situ?

У разі гібридизації in situ або Флуоресценція in situ гібридизація нуклеїнові кислоти з РНК або ДНК виявляються в певних тканинах або клітині за допомогою молекулярно-генетичних методів. Зазвичай такий тип діагностики використовується для виявлення структурної або числової хромосомної патології під час вагітності.

Для цього використовується штучно виготовлений зонд, який сам складається з нуклеїнової кислоти. Потім він зв'язується з нуклеїновими кислотами в організмі шляхом спарювання бази. Цей зв’язок мається на увазі під терміном гібридизація. Докази ґрунтуються на живій структурі пацієнта і тому відповідають in situ. Це слід відрізняти від методів in vitro, у яких виявлення відбувається в пробірці. Метод був розроблений у 20 столітті вченими Джо Голлом та Мері Лу Парду.

Технологія розвивалася з тих пір. У той час, коли в той час використовувались радіоактивні зонди, наприклад, сьогодні застосовуються мічені флуоресценцією зонди з ковалентним зв'язком з молекулами маркера.

Функція, ефект та цілі

Інцидентна гібридизація зазвичай використовується для виявлення хромосомних аберацій, тобто хромосомних аномалій, які не можуть бути виявлені в каріограмі. Це означає, що метод завжди застосовується, коли слід визначити спадкові захворювання під час вагітності.

Оскільки хромосомні аберації є проблемою, яку сьогодні не варто недооцінювати, використання методу з часом зростає. Гібридизація відбувається на основі нативних клітин із навколоплідних вод матері. В основі технології лежить зв'язування кольорового зонда з частинами ДНК. Завдяки зв’язуванню кількість пізніх копій можна згодом оцінити за допомогою мікроскопа, оскільки окремі копії випромінюють світловий сигнал і, таким чином, можуть бути видимими під мікроскопом. Існують різні процедури. Або аналіз відбувається відразу після зв'язування.

У цьому випадку використовується флуоресцентний барвник, такий як біотин, який пов'язаний безпосередньо з ДНК-зондом. При непрямому методі in-situ гібридизації оцінка не може бути проведена відразу після гібридизації, оскільки флуоресцентні речовини можуть зв'язуватися з зондом лише після гібридизації. Цей непрямий метод використовується частіше, ніж прямий, оскільки він вважається більш чутливим. Крім хромосомно-специфічних центрометрових ДНК-зондів, існують також ДНК-зонди, специфічні для локусу, специфічні для хромосоми бібліотечні ДНК-зонди та порівняльна гібридизація геному.

Для виявлення хромосомних числових аномалій можна використовувати хромосомні специфічні центрометрові ДНК-зонди. Це означає, що вони в основному використовуються, коли є підозра на дублювані або видалені хромосоми. Зонди-специфічні ДНК-зонди особливо підходять для виявлення мінімальних мутацій, які не можуть бути виявлені в каріограмі. Хромосомоспецифічний бібліотечний ДНК-зонд використовується, зокрема, для виявлення вставки та транслокації.

Порівняльна гібридизація геному, з іншого боку, - це всебічний аналіз втрат і приростів хромосомного матеріалу. Сьогодні гібридизація in situ є дуже важливою для діагностики різних мутацій хромосом.У діагностиці синдрому Дауна, зонди, наприклад, зв'язуються з хромосомою 21. Для цього зазвичай використовують специфічні для хромосоми зонди, які можуть бути використані при підозрі на це захворювання.

Підозра може виникнути, наприклад, якщо батьки раніше народили дитину із захворюванням і зображення на УЗД ненормальне. Якщо замість подвійного зв'язку є потрійний і, таким чином, виводиться потрійний кольоровий сигнал, діагноз вважається підтвердженим.

Ризики, побічні ефекти та небезпеки

На відміну, наприклад, від ПЛР, in-situ гібридизація значно менше схильна до забруднення. Крім того, часу, необхідного для процесу, надзвичайно менше. Однак, оскільки, зокрема, ембріони утворюють хромосомні структури, модель не може бути використана для визначеності решти хромосомного розподілу, а отже, генетичного статусу інших клітин.

Кольорові сигнали також можуть перекриватися або залишатися невидимими з інших причин. Як наслідок, гібридизація in situ, як діагностичний інструмент, відносно схильна до помилок під час вагітності. Помилкові діагнози можуть виникнути, і батьки можуть вирішити проти здорового ембріона. Щоб знизити сприйнятливість до помилок гібридизації in situ, слід досліджувати принаймні дві ембріональні клітини одночасно. Вивчаючи дві клітини паралельно, зараз існує лише незначний ризик помилкової діагностики.

У такому випадку батьки можуть абсолютно покластися на діагноз. Гібридизація на місці пропонується не кожній вагітній жінці, а лише жінкам із групи ризику. Тим не менш, вагітним жінкам не заперечують такий тип діагнозу за власним бажанням. Ненормальні результати ультразвуку або аномальна сироватка можуть спонукати лікаря запропонувати діагностичну процедуру. Хоча велика частина, але далеко не вся, хромосомних аберацій може бути діагностована за допомогою in situ місця гібридизації.

Тому гібридизацію in situ не слід проводити поодинці, а завжди її використовувати разом із звичайним тестом на хромосому. Догляд за вагітною жінкою відіграє головну роль у цій процедурі. Перед аналізом проводиться поглиблена дискусія з майбутньою мамою про метод діагностики, в якому пояснюються ризики, можливості та межі технології.